细胞代谢涉及诸多关键的代谢中间体，而代谢中间体浓度的变化也反映着细胞代谢的调控过程，发展生物工具以实时监测这些代谢中间体对于我们理解代谢过程具有重要意义。为了填补目前这类生物工具缺乏的空白，本文的研究人员发展了一种基于RNA的生物传感器以实现对Fructose 1,6-bisphosphate (FBP)浓度的实时监测，FBP是糖酵解过程中重要的代谢中间体，该工具的发展对于我们理解糖酵解过程的调控具有重要意义。
图1. RNA文库的构建以及筛选(A) RNA文库的构建；(B)结合FBP的核酸适配体；(C)与DFHBI变构结合的RNA G-四联体结构；(D) μIVC筛选流程
为了筛选得到能够响应FBP浓度变化，并给出相应荧光信号的RNA生物传感器，作者在一系列尝试后确定了RNA文库的构建方式（图1A）。该RNA文库包括两部分，一部分为能够结合FBP的核酸适配体（图1B），另一部分是特殊的RNA G-四联体结构（图1C），该结构可以与DFHBI结合（DFHBI是GFP的小分子类似物，与G-四联体结构结合后能够发绿色荧光），且该结合受变构调控。构建好文库后，作者尝试利用传统的基于亲和分离的SELEX方法进行文库筛选，然而该方法需要对RNA进行胶回收，这导致筛选得到很多RNA截短体，大大影响了筛选结果。作者转而使用μIVC (microfluidic-assisted in vitro compartmentalization)筛选流程（图1D），该流程基于微流控芯片将RNA突变体分离到不同液滴中，进而检测其荧光响应。在该方法的帮助下，作者最终筛选得到了突变体Sensor 81，Sensor 81能够识别FBP，进而诱导G-四联体结构与DFHBI变构结合，以发出绿色荧光信号。
图2. Sensor 81的体外表征(A) Sensor 81对DFHBI结合的EC50测试 ；(B) Sensor 81的点突变实验；(C) Sensor 81的识别特异性表征
之后作者对Sensor 81（后面简写为s81）进行了体外表征，EC50实验表明s81在添加FBP后能够与DFHBI结合并给出荧光信号，而不添加FBP则无荧光信号（图2A）。为了验证筛选的可靠性，作者在s81的关键位置进行了单点突变以及多点突变，所有得到的突变体表现均不如s81本身，证明筛选过程以及筛选得到的s81较为可靠（图2B）。然后作者对s81的识别特异性进行了表征，作者发现，在糖酵解过程涉及的几种代谢物中，s81对FBP的识别最好（图2C），证明识别具有特异性。
图3. Sensor 81应用于活细胞(A) Oligomycin处理细胞能够使细胞中FBP浓度升高 ；(B) Sensor 81能够监测到Oligomycin处理导致的FBP浓度升高
最后，作者证明了s81能够应用于活细胞中，以检测活细胞中FBP的水平变化。作者以Oligomycin处理HEK293T细胞，Oligomycin的引入会导致乙酰CoA到ATP的转化过程受阻，进而使细胞中FBP的水平升高（图3A）。Sensor 81能够在活细胞中成功监测到Oligomycin介导的FBP浓度升高的过程（图3B），证明了该工具能够在活细胞中实现应用。
综上，作者通过RNA筛选的手段得到了一种基于RNA的生物传感器，以在活细胞中监测FBP的水平变化，该工作首次开发了监测关键代谢物浓度变化的生物工具，对研究代谢过程具有重要意义。
